Cuộc cách mạng trong xét nghiệm bệnh truyền nhiễm

01
Th12

Các bệnh truyền nhiễm (ID) vẫn cướp đi sinh mạng của 14 triệu người trên toàn thế giới mỗi năm, chiếm một phần tư tổng số ca tử vong. Điều này khiến chúng trở thành nguyên nhân tử vong hàng đầu.

Việc quản lý ID phụ thuộc vào chẩn đoán chính xác và nhanh chóng. Bắt đầu với bản ghi chép đầu tiên của Anton von Leuwenhoek về các vi khuẩn, hay vi động vật, tiến triển thành các xét nghiệm vi sinh, bao gồm các kỹ thuật nuôi cấy và nhuộm. Tuy nhiên, những xét nghiệm này tiến triển chậm so với sự tinh vi đáng kinh ngạc đạt được trong các lĩnh vực chẩn đoán khác như sinh hóa và X quang . Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để giảm độ trễ thời gian và công sức lao động chân tay liên quan đến phương pháp tiếp cận này.

Nguồn hình ảnh: nito/Shutterstock

Nguồn hình ảnh: nito/Shutterstock

Những kỹ thuật này không chỉ cồng kềnh và chậm chạp mà còn đòi hỏi đội ngũ nhân viên được đào tạo bài bản và các mẫu được thu thập cẩn thận, thường là dịch cơ thể. Cả độ chính xác, về độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị dự đoán âm tính và dương tính, và lợi ích của các xét nghiệm này, về mặt sức khỏe của bệnh nhân, đều được mong muốn như nhau đối với bất kỳ công nghệ phòng xét nghiệm nào.

Điều đáng chú ý là các nhà nghiên cứu đã đưa ra các đặc điểm CHẮC CHẮN mô tả xét nghiệm chẩn đoán lý tưởng: Giá cả phải chăng, Nhạy cảm, Cụ thể, Thân thiện với người dùng, Nhanh chóng, Không cần thiết bị và Cung cấp cho những người có nhu cầu.

Kiểm tra tại điểm chăm sóc

Một tiến bộ lớn trong lĩnh vực này là sự ra đời của các xét nghiệm nhanh tại điểm chăm sóc (POCT). Chúng bao gồm các xét nghiệm chẩn đoán nhanh (RDT) dựa trên phương pháp kính hiển vi trực tiếp hoặc phương pháp nhận dạng kháng nguyên dựa trên kháng thể. Chúng bao gồm ngưng kết, xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme, xét nghiệm miễn dịch quang học và xét nghiệm dòng chảy bên (LFA) dựa trên miễn dịch sắc ký.

Các xét nghiệm như vậy hiện có sẵn cho Chlamydia, nhiều tác nhân gây tiêu chảy, mầm bệnh đường hô hấp, bệnh đường sinh sản, Treponema, Trichomonas và một số loại nấm. RDT thường được xác nhận bằng các xét nghiệm bổ sung, dựa trên kháng nguyên hoặc xét nghiệm axit nucleic .

Kính hiển vi trực tiếp trong các mẫu lâm sàng phụ thuộc vào việc quan sát tác nhân gây bệnh trong các mô, thường sử dụng các vết nhuộm mô học hoặc bổ sung bằng các vết nhuộm nhắm mục tiêu miễn dịch hoặc axit nucleic. Đánh dấu huỳnh quang có thể tăng thêm tiện ích của phương pháp sau.

Các phương pháp dựa trên kháng thể phụ thuộc vào việc mẫu chứa kháng nguyên của bệnh nhân đi qua một ma trận trong đó các kháng thể được liên kết. Sự liên kết kết quả tạo ra kết quả đọc màu, huỳnh quang hoặc tương tự dễ hiểu.

Aptamer liên kết một số thành phần vi khuẩn có ái lực cao có thể được thay thế cho các kháng thể dễ vỡ hơn do nhiệt, do đó làm cho RDT chịu được khí hậu nhiệt đới hơn trong các phiên bản tương lai. Tăng cường tín hiệu là một lĩnh vực khác cần được cải thiện để tăng độ nhạy của các xét nghiệm này ở nồng độ chất phân tích thấp. Mảng kháng thể trên một nền tảng cũng đang được xem xét để cho phép sàng lọc hoặc chẩn đoán bất kỳ ID nào trong số nhiều ID bằng một xét nghiệm duy nhất.

Quy mô lớn của xét nghiệm COVID-19 đã cho phép đánh giá toàn diện các xét nghiệm này so với tiêu chuẩn vàng, cho dù là phản ứng chuỗi polymerase hay xét nghiệm chuẩn khác. Độ ổn định, sức mạnh sản xuất, tiêu chuẩn vận hành và khả năng xảy ra lỗi kỹ thuật do thiếu kỹ năng của những người thực hiện xét nghiệm không thể sánh được với các tiêu chuẩn của xét nghiệm trong phòng thí nghiệm chính thức. Tuy nhiên, chúng có thể rất hữu ích khi các xét nghiệm phức tạp hơn bị loại trừ vì lý do chi phí, tính khả dụng hoặc các yếu tố kỹ thuật.

Ví dụ, các POCT này thường được sử dụng để sàng lọc nhiều lần những người lao động không có triệu chứng hoặc trẻ em đi học theo định kỳ.

Một loại POCT thứ hai dựa trên chẩn đoán phân tử, với kết quả có trong vài phút thay vì vài giờ. Tính hợp lệ của nó vẫn đang được xác định thông qua nghiên cứu đang diễn ra. Hai nền tảng mới dựa trên khối phổ là khối phổ thời gian bay ion hóa khử hấp phụ bằng laser hỗ trợ ma trận (MALDI-TOF MS) và khối phổ ion hóa phun điện (ESI)-phản ứng chuỗi polymerase (PCR).

MALDI-TOF nhắm đến việc phát hiện các nuôi cấy vi khuẩn trong các tình trạng như nhiễm trùng huyết tiết niệu, nơi nuôi cấy vừa tốn thời gian vừa thường không chính xác. Dựa trên việc phát hiện protein ribosome bằng khối phổ (MS), nó được đánh giá cao vì tốc độ, chi phí thấp và tính đơn giản khi vận hành. Nó được sử dụng trong nhiều phòng thí nghiệm ở Châu Âu, mặc dù công việc vẫn tiếp tục cải thiện khả năng phân biệt một số loài của nó.

Một số nhà khoa học khẳng định rằng “ MALDI đang nhanh chóng trở thành phương pháp được lựa chọn để xác định vi khuẩn kỵ khí ”. Phương pháp này thường được bổ sung bằng phương pháp đo lưu lượng nước tiểu. Mặc dù phương pháp này chủ yếu được sử dụng để xác định mẫu trong nuôi cấy, nhưng có thể cải tiến để sử dụng trên các mẫu chính.

PCR-ESI MS có thể được phát triển để chẩn đoán hầu hết các tác nhân gây bệnh một cách nhanh chóng và chính xác.

Nguồn hình ảnh: MilanMarkovic78/Shutterstock

Nguồn hình ảnh: MilanMarkovic78/Shutterstock

NAAT

Nhiều loại đầu dò dựa trên axit nucleic và xét nghiệm khuếch đại axit nucleic (NAAT), chẳng hạn như phản ứng chuỗi polymerase (PCR), đã có từ hơn ba thập kỷ. Chúng thường được coi là đại diện cho tương lai của vi sinh học do kết quả tương đối nhanh nhưng chất lượng cao.

NAATs đã đi đầu trong sự tiến triển của bệnh do vi-rút corona 2019 (COVID-19) và nhiều thiết bị tự động để xét nghiệm thông lượng cao đã được giới thiệu trong đại dịch. Những thiết bị này giải quyết các vấn đề như thời gian xử lý lâu (TAT) và thời gian xử lý.

Một số bước đã được thực hiện để giảm TAT trong khi tăng thông lượng. Các công nghệ không phải PCR, bao gồm một loạt các xét nghiệm dựa trên khuếch đại trung gian phiên mã (TMA), các xét nghiệm khuếch đại đẳng nhiệt như khuếch đại đẳng nhiệt trung gian vòng lặp (LAMP) và các xét nghiệm dựa trên lặp lại palindromic ngắn xen kẽ đều đặn theo cụm (CRISPR)-Cas, cùng với nhiều xét nghiệm khác, đã bước vào lĩnh vực này.

Công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt không cần đến máy luân nhiệt nhưng được cho là có thể khuếch đại axit nucleic hiệu quả ít nhất là ngang bằng với PCR, khiến chúng rẻ hơn và ít phức tạp hơn.

LAMP có thể bao phủ một mảng mục tiêu lớn hơn PCR thông thường và tạo ra nhiều axit nucleic khuếch đại hơn. Tuy nhiên, các enzyme được sử dụng thường bị ức chế bởi các chất khác trong mẫu người, trong khi các đoạn mồi phức tạp. Các xét nghiệm đa kênh vẫn không phổ biến với nền tảng này.

CRISPR là một trong những đột phá lớn nhất trong vài thập kỷ qua và có thể kết hợp với các công nghệ khác để phát hiện axit nucleic ở mức rất thấp và với tốc độ cao. Một số ví dụ là Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing (SHERLOCK) và DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR), cũng như các kết hợp RT-LAMP-CRISPR.

Những tiến bộ khác trong công nghệ NAAT bao gồm khả năng giảm số lượng mẫu trên mỗi lô, từ 96 xuống còn một, chỉ bằng cách sử dụng các mô-đun chiết xuất và khuếch đại riêng biệt. Sự phân tách các bước khác nhau này cho phép phòng thí nghiệm tải các mẫu mới, dù là các lô nhỏ hay các mẫu đơn lẻ, trước khi lô trước đó được thử nghiệm hoàn toàn. Kết quả là có khả năng thực hiện một nghìn hoặc nhiều xét nghiệm hơn mỗi ngày trên mỗi thiết bị.

Phòng thí nghiệm trên một con chip

Kỹ thuật vi lưu đã cho phép phát triển các thiết bị phòng thí nghiệm trên chip, tích hợp khuếch đại phân tử, lai phân tử và phát hiện quang học hoặc điện hóa tinh vi để xác định các dấu hiệu sinh học của bệnh trong một hệ thống duy nhất, giá rẻ, tương thích với thiết bị cầm tay hoặc di động.

Cepheid và Veredus đã phát triển các nền tảng nguyên mẫu hiện đang được sử dụng. Những nền tảng này vẫn cần đầu vào năng lượng, thuốc thử ổn định về nhiệt độ và lưu trữ, và các kết quả dễ hiểu, điều này có thể hạn chế khả năng áp dụng của chúng trong các bối cảnh hạn chế về nguồn lực. Có thể cần các phiên bản đơn giản hóa cho tình huống này.

Đồng thời, tự động hóa nhiều hơn đã được giới thiệu, giảm thời gian thực hành và độ phức tạp của thử nghiệm. Mã vạch tích hợp cho phép theo dõi mẫu và thuốc thử trong khi dữ liệu được nhập tự động thông qua giao diện máy tính-thiết bị trong phòng thí nghiệm.

Phương pháp giải trình tự

Các bước khác bao gồm giải trình tự axit ribonucleic ribosome (rRNA), chẳng hạn như gen rRNA 16S trong vi khuẩn, và các vùng rRNA 28S và vùng đệm phiên mã giữa các gen (ITS) trong nấm.

Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) là một nền tảng thông lượng cao trong đó các trình tự đọc được tạo ra ở quy mô rất lớn trong một quy trình song song. Nó cũng đã cách mạng hóa việc giải trình tự các tác nhân gây bệnh, cho cả nhiễm trùng riêng lẻ và phân tích hệ vi sinh vật . Ví dụ, điều này giúp giải quyết tình trạng kháng thuốc hoặc theo dõi các đợt bùng phát tiềm ẩn.

Nguồn hình ảnh: Elpisterra/Shutterstock.com

Nguồn hình ảnh: Elpisterra/Shutterstock.com

Các kỹ thuật khác

Lai RNA và đếm kỹ thuật số là một công cụ đang được phát triển để phát hiện lượng rất nhỏ axit nucleic. Một nền tảng hoàn toàn tự động khác sử dụng khuếch đại RNA và lai ghép kết hợp với các hạt siêu thuận từ để phát hiện các amplicon cụ thể.

Các thử nghiệm dựa trên hạt nano, chẳng hạn như thử nghiệm của Nanosphere, đã được FDA chấp thuận, đang trở nên phổ biến nhưng đòi hỏi công nghệ tiên tiến để đưa các phân tử mục tiêu đã được tinh chế ở nồng độ thích hợp đến khu vực cảm biến của thiết bị vi lưu hoặc cảm biến nano.

Các nền tảng phát hiện quang cơ có thể sử dụng đầu dò aptamer hoặc axit nucleic, kháng nguyên hoặc kháng thể để nhận dạng các hạt, như với cảm biến sinh học cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) hoặc giao thoa kế Young. Điều này sẽ tránh nhu cầu chiết xuất vi khuẩn hoặc thành phần.

Tự động hóa thử nghiệm trong phòng thí nghiệm

Mặt trận thứ ba cần cải thiện là việc đưa tự động hóa vào thay thế việc xử lý trực tiếp của nhân viên phòng thí nghiệm và y tế được đào tạo đối với các xét nghiệm rất phức tạp. Có nhiều lợi thế, bao gồm khả năng tái tạo cao hơn, khả năng xảy ra lỗi thấp hơn, không phụ thuộc vào tình trạng thiếu hụt nhân lực, thông lượng cao hơn và thậm chí bảo quản thuốc thử và mẫu vật bằng cách sử dụng vi lưu trong một số trường hợp.

Những hệ thống này sẽ không hoàn toàn không có con người vì đội ngũ nhân viên được đào tạo phải điều hành toàn bộ quy trình làm việc, duy trì lượng thuốc thử dự trữ cao, giám sát kết quả và can thiệp khi cần thiết theo yêu cầu của nền tảng. Sẽ cần rất nhiều nỗ lực để đảm bảo rằng các hệ thống thiết bị này hoạt động trơn tru và, khi cần thiết, tạo ra kết quả tương đương với tiêu chuẩn vàng hiện tại.

Bộ sưu tập mẫu

Việc thu thập mẫu cũng đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu gia tăng trong quá trình tìm kiếm các phương pháp thu thập mẫu không xâm lấn và tại nhà. Cần phải có nhiều công trình hơn, trên quy mô lớn hơn, với tài liệu ghi chép cẩn thận, để so sánh hiệu quả của các loại mẫu khác nhau trong việc chẩn đoán các tác nhân gây bệnh lây lan nhanh. Mặc dù điều này có thể rất hữu ích trong việc ngăn chặn sự lây lan của bệnh nhiễm trùng, bằng cách cho phép xác định sớm hơn các trường hợp, cần phải cẩn thận để thu thập mẫu một cách chính xác.

Mẫu gộp

Sử dụng mẫu gộp là một chiến lược vừa đẩy nhanh kết quả vừa bảo toàn thuốc thử và mẫu vật. Nếu một nhóm mẫu âm tính khi xét nghiệm, tất cả các mẫu riêng lẻ đều được tuyên bố là âm tính, trong khi kết quả dương tính đòi hỏi phải xét nghiệm riêng từng mẫu trong nhóm. Chiến lược này hữu ích nhất trong những tình huống khi tỷ lệ nhiễm trùng thấp và nguồn cung thuốc thử bị hạn chế.

Hạn chế của phương pháp này chủ yếu nằm ở nhu cầu tập hợp các mẫu có biên độ sai số thấp và hạn chế việc xử lý mẫu của con người.

Kết luận

Khi chẩn đoán nhanh chóng và bắt đầu điều trị được công nhận là thành phần thiết yếu của việc quản lý ID.

Tài liệu tham khảo

Bài viết được Dược Phẩm Mộc Lâm lược dịch từ bài viết của TS. Liji Thomas đăng trên News Medical